Molekyylibiologiassa hyvä puskurivalinta ja valmistelu erilaisiin DNA-eristysvaiheisiin voivat olla ero proteiinin ilmentymiseen siirtymisen tai toisen maxi-prep-kitin avaamisen aloittamiseksi. Huolimatta niiden ratkaisevasta merkityksestä puskurirepeptit ovat usein vain niitä reseptejä, jotka on kirjoitettu ilman eri osien selityksiä tai perusteluja. Yksi tällainen puskuri on glukoosi-tris-EDTA- tai GTE-puskuri.
$config[code] not foundMitä GTE käyttää?
GTE: tä käytetään bakteerisolujen uudelleen suspendoimaan ennen solujen hajottamista ja plasmidi-DNA: n keräämistä sisälle. Lysotsyymiä, joka pehmentää solukalvoja, lisätään usein yhdessä GTE-puskurin kanssa. Täydellisten solujen homogeenisen suspension aikaansaaminen tämän vaiheen aikana niin, että myöhemmin lisätty lyysi- liuos pääsee kaikkiin soluihin, on avain hyvien DNA-saantojen saamiseen. GTE on suunniteltu siten, että se tarjoaa myös vakaan ympäristön DNA: lle.
Glukoosi Osmolariteetille
50 mM (millimolaarinen) glukoosisokeri lisätään GTE-puskuriin osmolaarisuuden ylläpitämiseksi, jos solujen pitoisuus solujen ulkopuolella on lähellä solujen sisäistä konsentraatiota. Tämä estää ennenaikaisen solujen hajoamisen, joka voi aiheuttaa alhaisempia DNA: n saantoja aggregaation ja hajoamisen vuoksi. Puskurin muut komponentit edistävät myös liuoksen osmolaarisuutta, mutta glukoosi, joka on ei-elektrolyytti, on hyvä valinta, koska se ei häiritse liuoksen puskurin ominaisuuksia.
PH-stabiilisuus Tris
Tris on tris (hydroksimetyyli) aminometaanin lyhyt nimi, joka on hyvin yleinen pH-puskuri. GTE-puskurin tapauksessa happosuola (Tris-HCl) lisätään puskuriin pitoisuutena 25 mM. Tämä ylläpitää liuoksen pH: n lähellä fysiologista 8,0, joka on ihanteellinen pH estämään plasmidi-DNA: n happohydrolyysi ja muiden solukomponenttien ei-toivotut sivureaktiot.
EDTA estää DNA: n hajoamisen
EDTA tai etyleenidiamiinitetraetikkahappo, sieppaa tai "kelatoi" metalli-ioneja liuoksesta, mikä estää niitä osallistumasta ei-toivottuihin sivureaktioihin. GTE-puskurissa EDTA: ta lisätään 10 mM: ssä. Sen ensisijainen tarkoitus on puskurissa, joka pyöristää vapaata sinkkiä, magnesiumia ja kalsiumia ja estää siten DNA: n hajoamisen tietyillä reiteillä, jotka vaativat näitä metalleja.
Tärkeitä vinkkejä
Pidä GTE-puskurisi kylmä ja tee se pieninä määrinä, jotta estetään tahattomien bakteerien kasvu. Sokeri ja kontrolloitu pH muodostavat suuren kasvualustan. Käytä aina puhdistettua vettä. Vesijohtovettä voi olla ylimääräistä metalli-ioneja putkista, mikä voi ylittää EDTA: n kyvyn kaapata. Jos epäilet, että näytteessäsi on häiritsevää RNA: ta, lisää RNaasi A 100 mikrogrammaa millilitraa kohti GTE-puskuriin ongelman poistamiseksi.
